Після перемоги над Боузером брати-сантехніки Маріо та Луїджі стають героями Грибного королівства. Сам же колишній лиходій перетворюється на зменшену версію самого себе і живе в іграшковому замку, де за його перевихованням стежать принцеса Піч та її вірний слуга Тоад. Спокій у королівстві порушує Боузер-молодший, який викрадає хранительку космосу Розаліну, щоб використати її чарівні здібності для звільнення свого батька та завоювання галактики. Маріо, Луїджі та їхній новий друг-динозаврик Йоші, прагнучи зірвати злодійські плани, вирушають у пригоду галактичного масштабу.